شبكة ومنتديات ام العلوم الثقافية
عزيزي الزائر / عزيزتي الزائرة يرجي التكرم بتسجبل الدخول اذا كنت عضو معنا
او التسجيل ان لم تكن عضو وترغب في الانضمام الي اسرة المنتدي
سنتشرف بتسجيلك
شكرا
ادارة المنتدي


منتدى العلوم والثقافة في العالم ._ يختص بمجال العلوم والثقافة
 
الرئيسيةدخولالتسجيلالبوابة

شاطر | 
 

 صبغ الكائنات الدقيقة

استعرض الموضوع السابق استعرض الموضوع التالي اذهب الى الأسفل 
كاتب الموضوعرسالة
فتحى محمود
زراعي جديد
زراعي جديد



الهواية :
عدد المساهمات : 7
السٌّمعَة : 1
نقاط : 21
تاريخ التسجيل : 19/11/2012
الساعه :

مُساهمةموضوع: صبغ الكائنات الدقيقة   الإثنين نوفمبر 19, 2012 11:25 am

بسم الله الرحمن الرحيم
صبغ الكائنات الدقيقة
The staining of microorganisms

رؤية البكتريا الحية يعتبر عملية صعبة جدا ليس فقط لانها صغيرة الحجم ولكن لانها أيضا عديمة اللون وشفافة وتباينها فى الوسط المائى لا يكفى لرؤيتها، لذلك تستعمل بعض الصبغات لتجعلها مرئية.
الصبغة :- هى عبارة عن أملاح أحد أيوناتها ملونه.
فوائد التصبيغ :-
(1) التباين بين البكتريا والخلفية الموجودة عليها ( إظهار البكتريا)
(2) توضيح شكل البكتريا ( كروى , عصوى , لولبى ....)
(3) التفريق بين أنواع البكتريا حسب التفاعل الصبغى
(4) تسهيل دراسة التراكيب الداخلية للخلية البكتيرية ( الكابسول , الابواغ , الأسواط.....)
(5) فحص الأمراض
خطوات التصبيغ :-
1/ تحضير المسحة البكيرية أو الغشاء البكتيرى preparation of Bacterial smear:-
المسحة عبارة عن تحضير من خلايا الأحياء الدقيقة يتم تثبيته على شريحة زجاجية لفحصه تحت المجهر .
يجب أن تكون الشريحة الزجاجية نظيفة وخالية من الدهون.
المواد المطلوبة :
• نمو بكتيرى على وسط صلب و اخر على وسط سائل .
• شرائح زجاجية نظيفة
• كحول, قطن, موقد بنزين, إبرة ذات حلقة loop , ماء مقطرمعقم أو ملح normal saline
خطوات العمل :
• المزرعة السائلة Broth culture :
مرر شريحة نظيفة سريعا على لهب موقد بنزين
عقم الإبرة ذات الحلقة لدرجة الإحمرار
خذ بواسطة الإبرة المعقمة من المستنبت السائل ملئها مره أو مرتين وضعها فى مركز الشريحة
أنشر جيدا فى مساحة 1سم مربع تقريبا
أترك الغشاء يجف فى الهواء
ثبت الغشاء بتمريره على اللهب لمرتين أوثلاثة مرات

• المزرعة الصلبة Solid culture :
مرر شريحة نظيفة سريعا على لهب موقد بنزين
عقم الإبرة ذات الحلقة لدرجة الإحمرار
خذ بواسطة الإبرة المعقمة نقطة الى نقطتين من الماء المقطر أو الملح Normal saline وضعها فى مركز الشريحة , عقم الإبرة مرة أخرى .
أنقل قليلا من النمو البكتيرى بواسطة الإبرة المعقمة الى الشريحة ثم أخلط الخلايا مع الماء فى مساحة 1سم مربع , إستمر فى الخلط حتى يتكون غشاء رقيق منتظم
أترك الغشاء يجف فى الهواء
ثبت الغشاء بتمريره على اللهب لمرتين أوثلاثة مرات


2/ تثبيت الشريحة Fixation of slide :-
لابد من تثبيت العينة ( المسحة ) على الشريحة قبل صبغها ويكون ذلك إما بالحرارة أو بالمواد الكيميائية مثل الكحول.
التثبيت بالحرارة يكون بتمرير الشريحة الزجاجية فوق اللهب بصورة سريعة مرتين الى ثلاث مرات .
الغرض من التثبيت:
(1) يعمل على لصق البكتريا على الشريحة الزجاجية
(2) يحفظ تركيب البكتريا من التحلل لأن الحرارة توقف عمل الإنزيمات
(3) التثبيت يقتل البكتريا وبالتالى يجعلها آمنة
(4) يقتل البكتريا وبالتالى يزيد من نفاذية جدارها للصبغة
(5) تصلب البروتين يؤدى الى عدم انتفاخ أو إنكماش البكتريا
(6) منع ذوبان مكونات البكتريا فى محلول الصبغة
أنواع الصبغات:-
توجد ثلاث أنواع رئيسية من الصبغات:
1/ صبغات بسيطة Simple stain : تستعمل فيها صبغة واحده إما قاعدية أو حمضية أو غير محدده التأثير , وعادة ماتستعمل الأصباغ القاعدية مثل ( أزرق الميثلين Methylene Blue و الكرستال البنفسجى Crystal Violetو الكربول فوكسين Carbol Fuchsin ) وذلك لأنها تتمكن من التفاعل مع الخلايا بحكم الإختلاف فى الشحنة الكهربائية بينها وبين هذه الخلايا ( الخلايا تحمل شحنة سالبة بسبب وجود الأحماض النووية).
الغرض من التصبيغ البسيط هو :
رؤية أشكال البكتريا

2/ صبغات مركبه (تفريقية) Differential stain :
يقصد بالصبغ التفريقى استخدام أكثر من صبغة واحدة وذلك للتمييز بين مجموعات بكتيرية مختلفة، أو للتمييز بين بعض أجزاء ومكونات الخلية البكتيرية نفسها، ومن أشهر الصبغات التفريقية ما يلي:
صبغة جرام Gram stain
الصبغة الصامدة للأحماض Acid – Fast Stain
الغرض من التصبيغ التفريقى:
التمييز والتفريق بين أنواع البكتريا وتقسيمها لمجموعات مثلا موجبة جرام Gram +ev وسالبة جرام Gram –ev أو مقاومة للأحماض Acid fast وغير مقاومة للأحماض Non acid fast
إظهار الفروق بين المكونات المختلفة للخلية .
3/ صبغات خاصة Special stain:
يستخدم هذا النوع من الصبغات لصبغ مكونات الخلية مثل الأبواغ الداخلية والتى تصبغ بصبغة أخضر الملاكيت Malachite green .





التصبيغ بالصبغات البسيطة
التصبيغ بصبغة أزرق الميثيلين Methylene Blue:
(1) حضر المسحة البكتيرية.
(2) أغمر الغشاء بمحلول صبغة أزرق الميثيلين(0.5%) لمدة 1-2 دقيقة ثم تخلص من الصبغة بإمالة الشريحة على الحوض .
(3) أغسل الشريحة بالماء ثم أتركها لتجف.
(4) ضع نقطة من الزيت وأفحص تحت العدسة الزيتية.















التصبيغ بالصبغات التفريقية

الصبغ بصبغة جرام Gram stain:-
تعتبر صبغة جرام من أهم أنواع الصبغات المستخدمة للتعرف على البكتيريا . و يعود الفضل في اكتشافها إلى الطبيب ذو الأصل الدانمركي هانس كريستيان جرام Hans Christian Gram وذلك عام 1880م .
قسمت هذه الصبغة البكتيريا إلى مجموعتين كبيرتين هى موجبة جرام Gram positive (G+ve) وسالبة جرام Gram negative (G-ve) ، استنادا إلى اختلاف اللون الذي تأخذه البكتيريا في هذه الصبغة.

تحتاج صبغة جرام لأربعة محاليل مختلفة:
(1) صبغة أساسية وهى الكرستال البنفسجى
(2) مرسخ وهو اليود
(3) مزيل للون وهو كحول 95%
(4) صبغة مضادة وهى السفرانين

الصبغة القاعدية :هى الصبغة التى يحمل الأيون الموجب منها لون الصبغة .
المرسخ: عبارة عن مادة تزيد القابلية أو الجذب بين الخلية والصبغة.
مزيل اللون: عبارة عن مادة تزيل الصبغة من الخلية المصبوغة، بعض الخلايا المصبوغة تزيل صبغتها بسهولة أكثر من خلايا أخرى.
الصبغة المضادة: هي صبغة قاعدية تختلف في لونها عن لون الصبغة الأساسية المستعملة والغرض من استعمال الصبغة المضادة هو إعطاء الخلايا التي أزيلت منها الصبغة الأساسية لونا يختلف عن لون الصبغة الأساسية. وهذا يعني ان هناك خلايا تحتفظ بلون الصبغة الاساسية ( اللون البنفسجي) وتسمى موجبة جرام اما الخلايا التي ‏ازيلت منها الصبغة الاساسية فإنها تأخذ لون الصبغة المضادة ( اللون الاحمر) وتسمى سالبة ‏جرام.
خطوات التصبيغ بصبغة جرام :
1/ جهز مسحة بكتيرية
2/ أغمر الشريحة بالكريستال البنفسجى لمدة 30 ثانية
3/ أغسل بالماء
4/ غط الغشاء بمحلول اليود واتركه لمدة 30 ثانية
5/ أغسل بالماء
6/ أغسل بالكحول 95% لإزالة اللون وذلك بإضافته نقطة نقطة مع إمالة الشريحة حتى يصير الكحول المتساقط عديم اللون.
7/ أغسل بالماء
8/ أصبغ بالصبغة المضادة وهى الصفرانين 30- 60 ثانية
9/ أغسل بالماء
10/ جفف الشريحة وافحص تحت العدسة الزيتية.
النتيجة:
البكتريا موجبة جرام تكتسب اللون البنفسجى أما سالبة جرام فتكتسب اللون الأحمر الزهرى



التصبيغ بالصبغات الخاصة
صبغ الأبواغ الداخلية للبكتريا Endospore staining

هناك بعض أنواع البكتريا اللاهوائية مثل الكلوستريديمClostridium والبكتريا الهوائية مثل الباسيلس Bacillusلديها مقدرة غلى تكوين الأبواغ spors وذلك عندما تكون الظروف غير مؤاتية لممارسة نشاطها كما فى حالة شح المواد الغذائية أو الجفاف .....
المواد المطلوبة:
بكتريا مكونة للأبواغ
دورق به ماء عند درجة الغليان
صبغة أخضر الملاكيت
صبغة سفرانين أو كاربول فوكسين
خطوات التصبيغ بصغة أخضر الملاكيت:
(1) حضر المسحة البكتيرية
(2) أغمر الشريحة بمحلول أخضر الملاكيت
(3) ضع الشريحة على حامل معرض لبخار الماء , عندما يبدأ محلول الصبغة فى التبخر أضف محلول الصبغة مرة أخرى إستمر فى الإضافة 3-4 مرات ( لمدة دقيقة تقريبا)
(4) أترك الشريحة تبرد ثم تخلص من المحلول .
(5) أغسل بالماء .
(6) أغمر الشريحة بمحلول السفرانين لمدة 20 – 30 دقيقة .
(7) أغسل بالماء.
(Cool أترك الشريحة لتجف .
(9) أضف الزيت وأغحص تحت العدسة الزيتية
النتيجة:
تظهر الأبواغ باللون الأخضر بينما تظهر الخلية باللون الأحمر.
الرجوع الى أعلى الصفحة اذهب الى الأسفل
 
صبغ الكائنات الدقيقة
استعرض الموضوع السابق استعرض الموضوع التالي الرجوع الى أعلى الصفحة 
صفحة 1 من اصل 1

صلاحيات هذا المنتدى:لاتستطيع الرد على المواضيع في هذا المنتدى
شبكة ومنتديات ام العلوم الثقافية :: قسم المنتـــديـــــات العلميــــه :: المنتدي الزراعي-
انتقل الى: